В пробирки добавляют по капле 0,5 н. Н2Э04 для того, чтобы окраска исчезла, а затем содержание каждой пробирки аккуратно переливают в мерные колбочки объемом в 25 мл. Центрифужные пробирки 2-3 раза ополаскивают небольшими количествами дистиллированной воды, сливая ее в соответствующую мерную колбочку. Каждую колбочку затем доводят до метки дистиллированной водой и тщательно смешивают их содержание.
Первым этапом работы является получение калибровочной кривой, по которой в дальнейшем производят расчет количества холестерина в надпочечнике. Для этого исходный стандартный раствор холестерина (1 мг/1 мл) разводят в 5 раз (2 мл станд. раствора плюс 8 мл хлороформа). Получают рабочий раствор, 1 мл которого содержит 0,2 мг холестерина.
Из рабочего раствора делают 8 разведений, добавляя для достижения необходимой концентрации холестерина хлороформ.
Во все 8 проб добавляют по 0,5 мл уксусного ангидрида и по 4 капли конц. Н2504. Тщательно перемешивают и ставят в темное место на 25 мин.
Пробы приобретают зеленую окраску, интенсивность которой зависит от концентрации в них холестерина.
Колориметрируют растворы холестерина на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре и записывают, каким показаниям ФЭКа соответствует каждая из 8 использованных концентраций холестерина.
На основании полученных данных вычерчивают на миллиметровой бумаге калибровочную кривую, где по оси абсцисс наносят показания ФЭКа, а по оси ординат — концентрацию холестерина в пробе. Полученную кривую в дальнейшем используют для определения содержания холестерина в ткани надпочечника.
Надпочечники, очищенные от жира, взвешивают на торзионных весах. Навески по 15-30 мг гомогенизируют в гомогенизаторе с 5 мл спиртово-эфирной смеси. Гомогенат быстро центрифугируют и из полученной надосадочной жидкости пипеткой (с помощью резиновой груши) набирают по 2 мл в две пробирки. Одна из них идет для определения общего холестерина, вторая — для определения его эфиров. Обе пробирки кипятят на водяной бане до тех пор, пока не перестанет выделяться эфир (по запаху) и объем экстракта не уменьшится примерно до 1 мл. Затем для осаждения свободного холестерина в одну из пробирок добавляют 1 мл 1%-ного раствора дигитонина и содержимое обеих пробирок упаривают досуха в кипящей водяной бане. После охлаждения в обе пробирки добавляют по 5 мл хлороформа, встряхивают их, а затем фильтруют.
В пробе, в которой проводилось осаждение свободного холестерина, хлопьевидный белый осадок холестерин-дигитонина, нерастворимый в хлороформе, остается на фильтре и его выбрасывают.
В фильтрате этой пробы содержится только связанный холестерин, а во второй пробе — общий холестерин.