Собранную кровь ставят, по возможности, в холодное место или, по крайней мере, в тень. Через 0,5-1 час, когда вся кровь свернется, полезно 1 раз обвести края образовавшегося сгустка (между ним и стенками сосуда) скальпелем или стеклянной палочкой. Через несколько часов или на другой день (в зависимости от скорости свертывания) выделившуюся из кровяного сгустка сыворотку сливают и непосредственно вслед за этим используют для введения животным.
Несложный по технике и очень эффектный опыт представляет значительный интерес: как демонстрация роли гипофиза в эндокринной регуляции половых желез и как методика, позволяющая получать вполне пригодную для оплодотворения икру лягушек практически в любое время года.
У лягушек в яркой форме проявляется сезонность размножения. Брачный период наступает после пробуждения от зимней спячки неодновременно у разных видов: раньше всех у травяной лягушки (R. temporaria) под Москвой в середине или конце апреля, когда в прудах еще плавает лед, несколько позже у R. arvalis и R. ridb bunda и еще позже, под Москвой -в начале июня, у зеленой лягушки (R. esculenta).
В это время у лягушек происходит спаривание, причем копуляция продолжается несколько дней. Во время спаривания у самок происходит овуляция и выходящие из яичников яйца попадают в брюшную полость, а затем в яйцеводы. Продвигаясь по яйцеводам, яйцеклетки обволакиваются слизью и скапливаются в задней расширенной части яйцеводов, так называемом маточном отделе. При икрометании накопившиеся у самки в маточном отделе яйцеводов яйца извергаются в воду, в это же время у самца изливается семенная жидкость. Таким образом, несмотря на наличие спаривания, оплодотворение у лягушек наружное -яйцеклетки оплодотворяются в воде. В воде быстро разбухает студенистая оболочка яиц. После икрометания стенки яйцеводов спадаются (микроскопическое исследование обнаруживает характерную атрофию). До следующего сезона размножения овуляции не происходит.
Инъекцией гипофизарного препарата можно вызвать во внеурочное время овуляцию, переход яйцеклеток в яйцеводы и их дальнейшее продвижение в маточный отдел половых путей, а также икрометание. Так как у самцов сперму можно получить всегда, отложенные самкой яйца можно искусственно осеменить. Для этого необязательно даже дожидаться икрометания, так как яйца, взятые из маточных отделов яйцеводов, вполне пригодны для осеменения.
Методика опыта. Овуляцию лучше всего вызвать инъекцией суспензии из гипофизов лягушек. Поэтому для опыта необходимы:
1) лягушки-доноры, у которых будут извлечены гипофизы: на каждую самку — реципиента нужно 2-4 гипофиза от взрослых лягушек любого пола (лучшее действие оказывают гипофизы, взятые от самок);
2) взрослые самки — реципиенты, у которых будет вызвана овуляция;
3) самец — для получения спермы.
Приготовление суспензии из гипофизов лягушки. Каждой самке нужно ввести суспензию из 2-4 гипофизов. Гипофизы извлекаются следующим образом.
У взрослой лягушки (лучше 5) ножницами отрезают голову и срезают нижнюю челюсть. Вскрывают череп снизу, со стороны нёба. Для этого с нёбной части срезается слизистая оболочка и обнажается основание черепа. В центре дна черепа расположена крупная кость — парасфеноид (покровно-клиновидная), хорошо заметная и благодаря четырем выступам имеющая форму креста. Задний выступ короткий, расположен между боковыми затылочными костями. Передний выступ, самый длинный из всех четырех, располагается посередине нёба — между глазницами. Два поперечных (боковых) выступа составляют как бы перекладину креста.